DMP法(Fa)测(Ce)定(Ding)漆(Qi)酶(Mei)酶(Mei)活(Huo)

 DMP法(Fa)测(Ce)定(Ding)漆(Qi)酶(Mei)酶(Mei)活(Huo)

A.1 原(Yuan)理(Li)

漆(Qi)酶(Mei)能(Neng)氧(Yang)化(Hua)DMP为(Wei)3，(?)5，(?)3’，(?)5’-四(Si)甲(Jia)氧(Yang)基(Ji)二(?)苯(Ben)基(Ji)醌(?)，(?)该(Gai)产(Chan)物(Wu)在(Zai)470nm处(Chu)有(You)最(Zui)大(Da)吸(Xi)收(Shou)峰(Feng)，(?)其(Qi)消(Xiao)光(Guang)系(Xi)数(Shu)为(Wei)49.6 mmol^-1Lcm^-1，(?)在(Zai)一(Yi)定(Ding)浓(Nong)度(Du)范(Fan)围(Wei)内(Nei)该(Gai)产(Chan)物(Wu)浓(Nong)度(Du)与(Yu)其(Qi)吸(Xi)光(Guang)度(Du)值(Zhi)成(Cheng)线(Xian)性(Xing)关(Guan)系(Xi)，(?)通(Tong)过(Guo)测(Ce)定(Ding)吸(Xi)光(Guang)度(Du)的(De)变(Bian)化(Hua)值(Zhi)来(Lai)计(Ji)算(Suan)产(Chan)物(Wu)的(De)生(Sheng)成(Cheng)速(Su)率(Lu)，(?)酶(Mei)活(Huo)的(De)定(Ding)义(Yi)为(Wei)在(Zai)一(Yi)定(Ding)条(Tiao)件(Jian)下(Xia)，(?)每(Mei)分(Fen)钟(Zhong)氧(Yang)化(Hua)1 umol DMP或(Huo)生(Sheng)成(Cheng)1umol 3，(?)5，(?)3’，(?)5’-四(Si)甲(Jia)氧(Yang)基(Ji)二(?)苯(Ben)基(Ji)醌(?)所(Suo)需(Xu)要(Yao)的(De)酶(Mei)量(Liang)定(Ding)义(Yi)为(Wei)1个(Ge)酶(Mei)活(Huo)单(Dan)位(Wei)。(?)

A.2.1 柠(Ning)檬(Meng)酸(Suan)-磷(Lin)酸(Suan)氢(Qing)二(?)钠(Na)缓(Huan)冲(Chong)液(Ye)（(?)pH 3.5）(?)

称(Cheng)取(Qu)柠(Ning)檬(Meng)酸(Suan)14.71g，(?)用(Yong)水(Shui)准(Zhun)确(Que)稀(Xi)释(Shi)至(Zhi)700ml，(?)称(Cheng)取(Qu)磷(Lin)酸(Suan)氢(Qing)二(?)钠(Na)14.33g，(?)用(Yong)水(Shui)溶(Rong)解(Jie)并(Bing)准(Zhun)确(Que)稀(Xi)释(Shi)至(Zhi)200 mL。(?)将(Jiang)柠(Ning)檬(Meng)酸(Suan)溶(Rong)液(Ye)加(Jia)入(Ru)到(Dao)磷(Lin)酸(Suan)氢(Qing)二(?)钠(Na)溶(Rong)液(Ye)中(Zhong)，(?)边(Bian)加(Jia)边(Bian)搅(Jiao)拌(Ban)并(Bing)调(Diao)pH至(Zhi)3.5。(?)

A.2 .2 DMP

    称(Cheng)取(Qu)DMP0.154g，(?)用(Yong)水(Shui)溶(Rong)解(Jie)并(Bing)定(Ding)容(Rong)至(Zhi)100mL。(?)

A.3 仪(Yi)器(Qi)和(He)设(She)备(Bei)

可(Ke)见(Jian)分(Fen)光(Guang)光(Guang)度(Du)计(Ji)

分(Fen)析(Xi)天(Tian)平(Ping)：(?)精(Jing)度(Du)为(Wei)±0.0001g。(?)

pH计(Ji)：(?)精(Jing)度(Du)为(Wei)±0.01 pH单(Dan)位(Wei)。(?)

恒(Heng)温(Wen)水(Shui)浴(Yu)：(?)精(Jing)度(Du)±0.2℃(?)

A.4 步(Bu)骤(Zhou)

漆(Qi)酶(Mei)酶(Mei)活(Huo)测(Ce)定(Ding)以(Yi)DMP为(Wei)底(Di)物(Wu)，(?)每(Mei)3ml反(Fan)应(Ying)体(Ti)系(Xi)含(Han)：(?)2.4ml柠(Ning)檬(Meng)酸(Suan)-磷(Lin)酸(Suan)氢(Qing)二(?)钠(Na)缓(Huan)冲(Chong)液(Ye)（(?)pH 3.5）(?)，(?)0.5ml DMP，(?)60 ℃(?)保(Bao)温(Wen)5 min，(?)加(Jia)入(Ru)0.1ml（(?)稀(Xi)释(Shi)适(Shi)当(Dang)倍(Bei)数(Shu)的(De)）(?)酶(Mei)液(Ye)，(?)同(Tong)时(Shi)按(An)下(Xia)秒(Miao)表(Biao)计(Ji)时(Shi)，(?)在(Zai)470 nm处(Chu)用(Yong)可(Ke)见(Jian)分(Fen)光(Guang)光(Guang)度(Du)计(Ji)在(Zai)0s时(Shi)记(Ji)录(Lu)一(Yi)次(Ci)吸(Xi)光(Guang)度(Du)值(Zhi)，(?)记(Ji)为(Wei)X₀，(?)间(Jian)隔(Ge)60s再(Zai)记(Ji)录(Lu)一(Yi)次(Ci)吸(Xi)光(Guang)值(Zhi)，(?)记(Ji)为(Wei)X₆₀。(?)

固(Gu)体(Ti)酶(Mei)制(Zhi)剂(Ji)测(Ce)酶(Mei)活(Huo)预(Yu)处(Chu)理(Li)：(?)称(Cheng)取(Qu)0.1g固(Gu)体(Ti)粉(Fen)末(Mo)，(?)加(Jia)1ml去(Qu)离(Li)子(Zi)水(Shui)溶(Rong)解(Jie)，(?)待(Dai)充(Chong)分(Fen)溶(Rong)解(Jie)后(Hou)8000rpm离(Li)心(Xin)5min，(?)取(Qu)上(Shang)清(Qing)按(An)上(Shang)述(Shu)方(Fang)法(Fa)测(Ce)其(Qi)酶(Mei)活(Huo)。(?)测(Ce)得(De)酶(Mei)活(Huo)单(Dan)位(Wei)为(Wei)U/ml，(?)换(Huan)算(Suan)成(Cheng)固(Gu)体(Ti)酶(Mei)制(Zhi)剂(Ji)的(De)酶(Mei)活(Huo)还(Huan)需(Xu)乘(Cheng)以(Yi)系(Xi)数(Shu)10，(?)酶(Mei)活(Huo)单(Dan)位(Wei)为(Wei)U/g。(?)

A.5 计(Ji)算(Suan)结(Jie)果(Guo)

E= ×n×7.258     …………………………………（(?)A.1）(?)

式(Shi)中(Zhong)：(?)

E：(?)酶(Mei)活(Huo)力(Li)，(?)U/ml

X₆₀：(?)60s时(Shi)记(Ji)录(Lu)的(De)吸(Xi)光(Guang)度(Du)值(Zhi)

X₀:0s时(Shi)记(Ji)录(Lu)的(De)吸(Xi)光(Guang)度(Du)值(Zhi)

n：(?)稀(Xi)释(Shi)倍(Bei)数(Shu)

A.6 精(Jing)密(Mi)度(Du)

    在(Zai)重(Zhong)复(Fu)性(Xing)条(Tiao)件(Jian)下(Xia)获(Huo)得(De)的(De)两(Liang)次(Ci)独(Du)立(Li)测(Ce)定(Ding)结(Jie)果(Guo)的(De)绝(Jue)对(Dui)值(Zhi)不(Bu)应(Ying)超(Chao)过(Guo)平(Ping)均(Jun)值(Zhi)的(De)3%。(?)

此(Ci)方(Fang)法(Fa)仅(Jin)作(Zuo)为(Wei)参(Can)考(Kao)，(?)具(Ju)体(Ti)环(Huan)境(Jing)不(Bu)同(Tong)，(?)相(Xiang)应(Ying)的(De)也(Ye)会(Hui)有(You)所(Suo)不(Bu)同(Tong)！(?)